网店装修 将分子封闭在蛋白质晶体中使反应过程可视化 基于x射线自由电子激光和量子化学计算的高精度分析

将分子封闭在蛋白质晶体中使反应过程可视化 基于x射线自由电子激光和量子化学计算的高精度分析 RSS 研究 公开日期: 2024.07.08 要点 成功地实时且在原子水平上跟踪了化学反应中分子的结构变化。 在蛋白质结晶中创造发生反应的“场”，再现溶液中的状态。 期待作为可视化各种化合物引起的化学反应，设计新分子功能的开发工具。 概要 东京工业大学生命理工学院生命理工系的特任助教迈提巴斯·胖子和上野隆史教授(兼同科学技术创建研究院自主系统材料学研究中心)的小组由东北大学多元物质科学研究所的南后惠理子教授(兼理化学研究所放射光科学研究中心组长)、 与筑波大学计算科学研究中心的庄司光男教授等人的研究小组共同将具有化学反应性的金属络合物[术语1]固定为蛋白质结晶[术语2]，开发了用x射线自由电子激光( XFEL ) [术语3]和量子经典混合( QM/MM )计算[术语4]在纳秒水平上跟踪化学反应中金属络合物的结构变化，阐明反应机理的技术。虽然人工分子反应[用语5]的追踪方法已有很多报告，但很难实时在原子水平上追踪反应时产生的活性种的结构变化。 本研究着眼于蛋白质晶体孔隙中存在大量水分子，成功地将金属络合物锰羰基络合物( Mn(CO )3)固定在仿佛溶液中的蛋白质环境中，在保持晶体的同时通过光照驱动金属–co键的裂解反应。 用XFEL照射固定了Mn(CO ) 3络合物的溶菌酶晶体[术语6]，观察了反应开始后很短时间( 10纳秒、100纳秒、1微秒后)的结构变化。 结果表明，CO配体选择性地依次解离。 此外，通过QM/MM计算，表明反应受到溶菌酶蛋白质环境的控制。 作为可视化各种低分子化合物发生的化学反应、理解反应机理的基础技术，利用稳定的蛋白质结晶细孔的该方法有望对“有用的分子催化剂的设计”和“复杂的分子反应机理的理解”做出贡献。 本成果于6月29日(当地时间)在自然科学领域的学术杂志《Nature Communications》的在线版上公开。 背景 在化学反应中确定短寿命的中间结构，关键是理解其反应机理。 但是，虽然有通过光谱学方法检测过渡性活性种形成的方法，但确定其中间结构并在原子水平上跟踪结构变化是困难的。 另一方面，近年来，通过使用基于x射线自由电子激光( XFEL )的时分连续飞秒晶体结构分析( TR-SFX )法[用语7]的三维立体结构分析，像逐帧动画一样捕捉蛋白质的结构变化的技术正在被开发。 该方法迄今多用于观察天然蛋白质和酶的结构变化，难以应用于合成金属络合物等低分子化合物促进的化学反应。 其理由是，低分子化合物时，反应时难以发生大的结构变化，而且难以得到结构数据。 因此，研究小组认为，通过使用蛋白质结晶作为合成金属络合物的反应场，可以追踪化学反应引起的合成金属络合物的结构变化，通过用TR-SFX法确定固定在蛋白质结晶内的金属络合物的光激发反应的中间结构，尝试了直接观察反应过程的结构变化(图1 )。

图1 .溶菌酶的晶体结构和本研究简图 研究成果 本研究组将光照释放一氧化碳( CO )的锰羰基( Mn(CO )3)配合物固定在多孔鸡卵溶菌酶( HEWL )晶体上，成功地通过TR-SFX法直接实时观察了CO释放反应中金属络合物的结构变化。考虑到光照射引起的反应在晶体内均匀发生，以及高效进行XFEL测量，为了长时间测量，需要大量尺寸小于20μm的微晶。 本结构分析研究了以5-10μm大小的溶菌酶四方晶体为模板晶体，用Mn(CO ) 3络合物溶液浸渍合成的晶体制备Mn(CO ) 3和HEWL的复合物。 正方晶在体积尺度上10分钟内可以大量合成晶体，内部存在2.2 nm的细孔空间。 对合成的Mn(CO )3-HEWL复合物的x射线结构分析结果表明，Mn(CO ) 3配合物配位固定在位于微孔表面的氨基酸His15上(图2 )。

图2. Mn(CO )3-HEWL复合物的晶体结构 其次，为了直接观察Mn络合物光激发化学反应的结构变化，在x射线自由电子激光( XFEL )设施SACLA[术语8]中采用纳秒泵浦激光，用365 nm的紫外光照射晶体，使Mn(CO ) 3络合物释放出CO。 照射光后10纳秒至1微秒，通过XFEL进行衍射实验，观察了像逐帧扫描一样从Mn(CO ) 3络合物中释放CO过程的中间结构。 Mn(CO ) 3络合物在光照前，3个CO配体和2个水分子在溶菌酶晶体内配位，具有八面体配位结构(图2 )。 光照中的一系列结构分析结果显示，轴向位的CO配体最先被释放，观察到了Mn双羰基物种作为中间体。 之后，北京希音产品建模位于ECO ( eq1 )的CO配体被释放出来，最终，释放出3个CO，Mn络合物也被释放出来。 并且，还可以可视化反应中引起的蛋白质侧链的参与及其结构变化(图3 )。 为了明确实验观测到的Mn络合物的CO释放的详细情况，进行了量子古典混合( QM/MM )计算。 利用光照前溶菌酶晶体内Mn(CO )3(H2O ) 2的结构构建QM/MM模型时，发现与Mn配位的3个CO周边存在溶菌酶的氨基酸残基，导致CO和水分子的交换反应随配位位置的不同而变化，发生选择性反应 另外，表明了用TR-SFX法直接观测到的结构位于主反应路径上。

图3 .溶菌酶晶体上固定的Mn(CO ) 3配合物释放CO过程的直接观察 今后的发展 为了追踪化学反应中低分子化合物的结构变化，本研究小组利用了稳定的蛋白质结晶的细孔空间的方法，可以在实时·实空间原子水平上可视化低分子化合物的活性中心的结构动力学。 今后，通过使用该方法，不仅是光照射的化学反应，还可以直接观察在将金属催化剂固定在蛋白质结晶上的人工金属酶内部驱动的催化反应的中间体结构等更加复杂的反应过程，有望在催化剂开发和医药品设计等方面得到广泛的应用。 社会冲击 高速跟踪化学反应的方法，至今为止也在开发，但在原子水平的分辨率上还没有达到。 为了追踪原子水平的反应过程，立体结构分析是必不可少的，但直接观察合成化合物的结构变化很困难。 本研究通过在具有高结晶性的蛋白质晶体上固定金属络合物，成功地将金属络合物的化学反应过程作为立体结构变化进行了观察。 从基于合成化合物的催化反应，到簇形成、超分子反应，本方法还可以实现迄今为止的方法中不可能实现的化学反应追踪，因此可以说具有很大的社会冲击。 附记 本成果由文部科学省科研经费资助事业( JP19H05781、JP19H05776、JP23H04879、JP20H05438、JP22H04744、JP23K04928、JP18H05421、JP22H00347 )、 这是由国立研究开发法人日本医疗研究开发机构( AMED )创药等生命科学研究支援基础事业创药等尖端技术支援基础平台( BINDS ) ( JP21am0101070 )、JST战略性创造研究推进事业CREST(JPMJCR20B3 )的支援所致。 术语说明 [术语1]金属络合物:具有金属离子与有机分子结合结构的化合物。 [术语2]蛋白质晶体:蛋白质分子有序三维排列的固体集合体。 通过分析蛋白质晶体x射线衍射的强度，可以确定蛋白质的三维立体结构。 [术语3] X射线自由电子激光( XFEL ) :具有x射线区域波长的激光，具有飞秒( 1，000万亿分之一秒)级的非常短的脉冲宽度。 XFEL是X-ray Free Electron Laser的缩写。 [用语4]量子古典混合( QM/MM )计算:发生化学反应的区域用高精度的量子力学( QM )计算处理，其他部分应用分子力学( MM )计算的计算方法。 [术语5]人工分子反应:由人工合成分子设计的化学反应，可以进行生物体内不可能的化学反应。 [术语6]溶菌酶晶体:水解酶溶菌酶三维聚集的结晶状集合体。 根据结晶条件，可以区分正方晶、斜方晶、单斜晶等不同空间群的结晶，大量合成微小结晶。 [术语7]时分连续飞秒晶体结构分析( TR-SFX )法:一种以高时间分辨率观察晶体中分子精细运动的方法。 给晶体施加引起结构变化的激光，在一定的延迟时间内进行x射线自由激光测量，可以跟踪晶体内蛋白质结构的变化。 TR-SFX是time-resolved serial femtosecond x-ray crystallography的缩写。 [术语8] X射线自由电子激光( XFEL )设施SACLA :由理化研究所和高亮度光科学研究中心共同建设的日本XFEL设施。 SACLA (樱)是来源于spring-8 angstrom compact free electron laser的设施爱称。 在小于10飞秒的脉冲时间内提供比SPring-8亮10亿倍的x射线。 由于照射时间短，因此可以在试样损伤引起蛋白质结构变化之前拍摄衍射像。论文信息 刊登的杂志: 美国航空公司 论文标题: real-time observation of a metal complex-driven reaction intermediate using a porous protein crystal and serial femtosecond crystallllographon 作者: Basudev Maity，Mitsuo Shoji，Fangjia Luo，Takanori Nakane，Satoshi Abe，Shigeki Owada，Jungmin Kang，Kensuke Tono，Rie Tanaka Mariko Kojima、Yuki Hishikawa、Junko Tanaka、Jiaxin Tian、Misaki Nagama、Taiga Suzuki、Hiroki Noya、Yuto Nakasuji、asuka numa DOI :10.1038/s 41467-024-49814-9 (外部site )

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